一、如何处理方式收到的细胞
1.新买的或惠赠的细胞如何处理方式？
不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手应赶紧做这几件事：检测瓶子是否破裂；培【péi】养基是否漏出，是否浑浊；是否有支原体污染；迅速扩增冻存。
2.能否使用与原先培养条件不同的培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应能力的细胞培养基【jī】，若骤然使用和原先提供服务培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应能力，造成细胞无【wú】法存活【huó】。
3.购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？
常见原因可能有：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度调节使【shǐ】用错误；培养箱气体浓度达不到要求；细胞置于【yú】–80℃太久。
二、复苏冻存的细胞
1.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损【sǔn】，建议【yì】使用止血钳小心夹取。另冷冻管【guǎn】瓶盖松动或松脱，是因热胀【zhàng】冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
2.冷冻管应如何解冻？
将冷冻【dòng】管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全【quán】性，可佩【pèi】戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂【liè】。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免【miǎn】由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
3.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？
现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO出去，但也有研究者认为除少数特别注明对【duì】 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入【rù】含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以【yǐ】去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞【bāo】无法生长或贴附的疑问。
三、细胞培养用液
1.如何正确选择培养基种类？
培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。
天然细胞培养基：是人们早期采用的细胞培养基，直接取【qǔ】自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基，富含氨基酸。血清是天然培养基中最有效和最常用的培养基，血清【qīng】的来源有胎牛血清、小牛或成牛血清、马血清、鸡【jī】血清、羊血清及人血清，最广泛【fàn】应用的为胎牛血清和小牛血清。
合成细胞培养基：是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等【děng】。由于细胞种类和培养条件不同，适合的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基【jī】有6～7 种【zhǒng】，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。
无血清细胞培养基：是指在使用中无需添加血清的细胞培养基，且其组成成分不含有任何动物组分。按照其组分分类，还可以分为无动【dòng】物组分无血清细胞培养基和化学限定【dìng】无血清细胞培养基，前者组分中可【kě】能含有某些植物来源成【chéng】分，而后者完全由化学成分明确的组分组成。
其中【zhōng】，无动物组分无血清细胞培养基是目前【qián】在生物制药行业中应用最广泛的，它提高了细胞培养的质量，避免了使用血清带来的麻烦。目前，已有多种无血清培养基上市，如杂交瘤【liú】细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、Vero细胞无血清培养基和NS0 细胞无血清培养基等。
2.什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在【zài】培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红【hóng】色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明【míng】，酚红可以模拟固醇类激素的【de】作用（特【tè】别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
3.细胞培养基的配制和储存应该注意什么？
细胞培养基配好后，要先抽取少许放入培养瓶内【nèi】在37℃培养箱内放置24~48h，已检测培养液是否有污染，然后方可用于【yú】实验。配置【zhì】培养基所需的血清要合格并且维持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配【pèi】液时调整pH值较容易。每次配液量以使用两周【zhōu】左右的量为宜，一次配液不要太多，一是短期内用不完造成营养成分损【sǔn】失需要补充，二是量大易造成污染。
4. 为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏暗红色？
培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，培养基内【nèi】的 CO2 会逐步溢【yì】出，造成【chéng】培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂 （通常为 phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2，以调整 pH 值。
5.可否使用与原先培养条件不同的血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的【de】营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极【jí】大的作用。来自不同【tóng】物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
6.血清灭活是否必须？
这个疑问现在有争议。有人主张价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50℃以上的温度调节长达30分钟的热处理方式会对血清中的生长因子，氨基酸等成分带来的负面作用。尽管如此，在大多数实【shí】验室之中血【xuè】清的热灭活还是作为常规来执行，尤其是在昆虫细胞和胚【pēi】胎干细胞培养【yǎng】中。
7.培养基中是否添加抗生素？
除特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基【jī】中不应添加任何抗生素。
8.何时更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间段，按时更换培养基即【jí】可。
四、细胞传代
1.细胞传代的方法都有哪些？
根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部【bù】分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代【dài】；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
2.原代培养的首次传代应注意的疑问？
细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代；原代培养时细胞多为混杂生长，不同的细胞有不同的消化时间段，因此要根据需【xū】要注意监视及时处理方式，并根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间段而分离和【hé】纯化所需要的细胞；吹打细胞时动作【zuò】要轻巧尽可能减【jiǎn】少对【duì】细胞的损伤；首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽【jìn】快适应能力新环境适应能力而利于细胞生存和增值；随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。
3.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？应如何处理方式？
EDTA作用较胰蛋白酶缓【huǎn】和，主要作用在于能【néng】从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重【chóng】要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。常用比例为1：1或者2份EDTA：1份胰【yí】蛋白酶。EDTA的工作液浓度【dù】为0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如【rú】果使用EDTA，在终止消化前，需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避【bì】免反复冷冻解冻造成胰蛋白酶的活性降低，并可减少污染的机会。
4.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率【lǜ】一般为【wéi】800~1000 rpm，5~10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。
5.细胞的接种密度为何？
依照细胞株基本数据上的接种【zhǒng】密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原【yuán】因之一。
6.细胞交叉污染的可能原因？
多种细胞系【xì】进行维持传代操作时，各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。
五、细胞冻存
1.冷冻培养基为什么要加DMSO？
因为细胞在不加任何保护剂的状况下直接冻存时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰【bīng】晶的形成将造成细胞损伤，还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性，分子量【liàng】小，溶解度大，易穿透【tòu】细胞，可以使冰点下降，提高包膜对水的通透【tòu】性。
2.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？
冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即为无菌状况，第一次开【kāi】瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可【kě】减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须【xū】使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。
3.欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x10^6 cells/ml vial 为宜。
4.冷冻保存细胞的方法？
冷冻保存方法一：冷【lěng】冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 长期储存。
冷冻保存方法二： 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长【zhǎng】期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过【guò】此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
5.细胞冻存太多会不会浪费？
每一种细胞【bāo】系都应有充足的冻存储备，防止由于【yú】细胞污染等因素造成的细胞系的绝种，而且每一批次培养的细胞状态都不同，应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时【shí】不【bú】用应冻存以免传代太多，造成细胞衰老或者发生改变。
