在细【xì】胞培养过程中，凡混入细胞培养环境中【zhōng】对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物【wù】都应视为细胞污染，轻则实验结果出不来，重则祸及他人（实验室），前期投入的人力、物力、财力和长期的坚持都付诸东流。细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。
一旦发现有细胞污染，我们该做些什么？
一、判定细胞污染类并处理方式
常见的细胞污染细胞培养中最常见污染的是【shì】细菌、真菌、支原体和黑胶虫污染，判断细胞是否污染的一种简单方法是观察培养基。我们将简要介绍几种常见的细胞污染类型及处理方式方法。
01细菌污染
特征：
◆ 细菌污染时细胞培养基可能在6-04小时呈现混浊。
◆ 有时稍加震荡，便会有很多混浊物漂起。
◆ 在显微镜下呈黑色细沙状，或背景有大量黑点。
细菌污染可能造成细胞增殖缓慢【màn】或形态上的改变（多角、多核等），胞质中产生【shēng】空泡、细胞漂浮凋亡。
处理方法：
| 抗生素 | 作用对象 | 使用比例 | 储存条件 |
| 卡那霉素溶液 | 细菌（如G+、G-、支原体） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 硫酸庆大霉素溶液 | 细菌（如G+、G-、支原体） | 稀释:1:1000 | AMB(6-04℃) |
| 青链双抗 | 细菌（如G+、G-） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 青链双抗，10浓缩液 | 细菌（如G+、G-） | 稀释:1:1000 | -20℃ |
| 青链霉素制霉菌素三抗 | 细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 青链霉素两性霉素B三抗 | 细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:100 | -20℃ |
| 青链霉素，新霉素三抗 | 细菌（如G+、G-） | 稀释:1:100 | -20℃ |
轻度细菌污染可用10X双抗清洗处理方式，重度细菌污染建议消杀后丢弃。
02真菌污染
特征：◆ 真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑。◆ 霉斑往往会漂浮在培养液表面，随着时间段逐步扩大。
◆ 有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物。
◆ 若是念珠菌会呈卵圆状，在细胞周边生长。
◆ 早期并不会使得培养基变黄变浑浊，但在显微镜下可监视到菌丝体。真菌形成的菌丝呈丝状，管状，树枝状，串珠状。
◆ 酵母菌等，当其行出芽生殖时可从一大一小的连体结构识别。
◆ 细胞被污染后，仍可生长，长时间段细胞的活力状态会变差。
◆ 梅雨季时的污染率会提高。
◆ 呈卵圆状酵母菌增殖到一定规模，形成团簇状的真菌群。
处理方法：
| 抗生素 | 作用对象 | 使用比例 | 储存条件 |
| 两性霉素B | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:1000-1:10,000 | -20℃ |
| 制霉菌素 | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释:1:100-1:1000 | -20℃ |
| 青链霉素制霉菌素三抗 | 细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释: 1:100 | -20℃ |
| 青链霉素两性霉素B三抗 | 细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀释: 1:100 | -20℃ |
细胞真菌污染较难根除，不建议保留，建议消杀后丢弃。
03支原体污染
最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜监视到。
感染支原体的细胞，在某一时间段点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。
细胞支原体污染可通过气溶胶传播，作用同一细胞房其他细胞。
特征：
◆ 增殖减慢
◆ 上清液清澈
◆ 背景干净
◆ 细胞形态异常（拉丝、铺展）
◆ 更换新的培养液，细胞状态没有恢复
鉴定方法：
PCR法、显色法、荧光染色法等。
示例1?EBTr (牛胚气管细胞)
感染了支原体的EBTr特征：
1.由成纤维样逐步变得类上皮样；
2.质膜铺展，溃烂；
3.轮廓不清，边界模糊；
4.凋亡细胞过多。
示例2?HT1080 (人纤维肉瘤细胞)
感染了支原体的人纤维肉瘤细胞特征：
1.由上皮样逐渐变得类成纤维样，胞体细长；
2.伪足伸长，出现明显的拉丝现象。
处理方法：
◆若细胞污染后状态尚可，添加支原体抑制剂培养6-04代可转阴
◆ 若细胞污染后状态很差，建议消杀后丢弃。
04黑胶虫污染
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细【xì】胞和培【péi】养基中的营养为生，并随细胞传代而传代，是一种异养生物。
特征：
镜下无法直接监视到。主要表现为细胞状态差，黑点和碎片多，布朗运动。通过检测发现主要为细胞支原体污染，部分为未知的增殖【zhí】不明显的微生物污染【rǎn】。
处理方式：
◆ 若细胞污染后状态尚可，添加黑胶虫抑【yì】制剂/支原体抑制剂培养6-04代可转阴
◆ 若细胞污染后状态很差，建议消杀后丢弃。
二、改善个人操作及培养环境
01清洁培养箱
发现细胞污染不能只处理方式这一个培养皿，还得看看这个恒温培养【yǎng】箱里其他培养皿或孔板里的细胞是【shì】否污染。
如果有而且好几个板子都有相似的污【wū】染块，那很可能是培养箱【xiāng】中的水或者空气污染了，得给培养箱做个大扫除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，不仅没了得加还得记得十天半个月的就用【yòng】酒精擦擦托盘。
02整理洁净台
超净台不是储物箱，什么培养皿、各种规格的板子、枪头【tóu】不要堆在超净台，会造【zào】成许多紫外线顾不到的卫生死角。
细胞房其他的桌面，同样切【qiē】忌【jì】东西堆积如山，不要将酒精棉球、标签纸、牛皮纸买来后全部堆在细胞房，污染物【wù】一不小心“飘”进你的细胞培养板里，细胞就会死给你看！
03严格无菌操作
细胞房这种卫生要求高的地方，人一旦多了救护增加许多不确定因【yīn】素，难以保证试验在无菌条件下操作。出入试验室，实验服当风衣穿，不扣纽扣，不戴鞋套，犹入无人之境，来去自由；超净台做实验时，喜欢说话聊着做试验【yàn】，殊不知你喷口气，里面就有很多细菌。
规范操作是避免污染的最有效方式。
细胞培养间配备枪式移液器【qì】、手术器械、离心机、冰箱等【děng】专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，并定期消毒。
专用物品只在培养间【jiān】内使用，不得带出细胞房。无【wú】菌操作工作区域应维持清洁及宽敞。必要物品可暂时放置，其他实验用品用【yòng】完即应移出，以利于气流的通畅。
培养细胞过程中使用的所有实验用具，如移【yí】液管、一次性枪头、一次性塑料离心管、冻存管等需【xū】121°C高压灭菌20分钟后烤干备用，一些玻璃器皿如细胞培养瓶等须先泡酸、洗净、晾干后再高压灭菌。
